正就讀中學的少年邁爾斯（沙梅克·摩爾 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬傷，隨后身體發生奇特的變化。偶然機緣，他目睹了蜘蛛俠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪頭目金并（列維·施瑞博爾 Liev Schreiber 配音）的戰斗。為了阻止金并利用時空對撞機擾亂宇宙，蜘蛛俠最終壯烈犧牲。可未過多久，來自平行宇宙的頹廢的彼德·帕克（杰克·約翰遜 Jake M. Johnson 配音）出現在邁爾斯面前。為了阻止金并的陰謀，并幫助這個帕克返回自己的宇宙，他們闖入金并的老巢。在這一過程中，二人遭到章魚博士和徘徊者的狙擊。與此同時，來自其他宇宙的女蜘蛛俠、暗影蜘蛛俠、蜘豬俠、二次元蜘蛛妹相繼出現。 　　他們合力與惡勢力展開斗爭……